aktualności

W ostatniej dekadzie technologia sekwencjonowania genów znalazła szerokie zastosowanie w badaniach nad rakiem i praktyce klinicznej, stając się ważnym narzędziem do odkrywania molekularnych cech nowotworów. Postępy w diagnostyce molekularnej i terapii celowanej przyczyniły się do rozwoju koncepcji precyzyjnej terapii nowotworów i przyniosły ogromne zmiany w całej dziedzinie diagnostyki i leczenia nowotworów. Testy genetyczne mogą być wykorzystywane do ostrzegania o ryzyku zachorowania na raka, wspomagania decyzji terapeutycznych i oceny rokowania, a także stanowią ważne narzędzie poprawy wyników leczenia pacjentów. W niniejszym artykule podsumowujemy najnowsze artykuły opublikowane w CA Cancer J Clin, JCO, Ann Oncol i innych czasopismach, aby omówić zastosowanie testów genetycznych w diagnostyce i leczeniu nowotworów.

Mutacje somatyczne i mutacje linii zarodkowej. Ogólnie rzecz biorąc, nowotwory są spowodowane mutacjami DNA, które mogą być dziedziczone po rodzicach (mutacje linii zarodkowej) lub nabyte z wiekiem (mutacje somatyczne). Mutacje linii zarodkowej występują od urodzenia, a mutator zazwyczaj przenosi mutację w DNA każdej komórki organizmu i może być przekazywany potomstwu. Mutacje somatyczne są nabywane przez osoby w komórkach niegametycznych i zazwyczaj nie są przekazywane potomstwu. Zarówno mutacje linii zarodkowej, jak i somatyczne mogą niszczyć normalną aktywność funkcjonalną komórek i prowadzić do ich złośliwej transformacji. Mutacje somatyczne są kluczowym czynnikiem złośliwości i najbardziej predykcyjnym biomarkerem w onkologii; jednak około 10 do 20 procent pacjentów z nowotworami jest nosicielami mutacji linii zarodkowej, które znacząco zwiększają ryzyko zachorowania na raka, a niektóre z tych mutacji mają również działanie terapeutyczne.
Mutacja kontrolna i mutacja pasażerska. Nie wszystkie warianty DNA wpływają na funkcjonowanie komórek; średnio potrzeba od pięciu do dziesięciu zdarzeń genomicznych, znanych jako „mutacje kontrolujące”, aby wywołać degenerację normalnych komórek. Mutacje kontrolujące często występują w genach ściśle związanych z czynnościami życiowymi komórki, takimi jak geny zaangażowane w regulację wzrostu komórek, naprawę DNA, kontrolę cyklu komórkowego i inne procesy życiowe, i mogą być potencjalnie wykorzystane jako cele terapeutyczne. Jednak całkowita liczba mutacji w każdym nowotworze jest dość duża, od kilku tysięcy w niektórych nowotworach piersi do ponad 100 000 w niektórych wysoce zmiennych nowotworach jelita grubego i endometrium. Większość mutacji nie ma znaczenia biologicznego lub ma je ograniczone, nawet jeśli mutacja występuje w regionie kodującym. Takie nieistotne zdarzenia mutacyjne nazywane są „mutacjami pasażerskimi”. Jeśli wariant genu w danym typie nowotworu przewiduje jego odpowiedź na leczenie lub oporność na nie, wariant ten uznaje się za klinicznie operacyjny.
Onkogeny i geny supresorowe nowotworów. Geny, które często ulegają mutacjom w nowotworach, można z grubsza podzielić na dwie kategorie: onkogeny i geny supresorowe nowotworów. W normalnych komórkach białko kodowane przez onkogeny odgrywa głównie rolę w promowaniu proliferacji komórek i hamowaniu apoptozy, podczas gdy białko kodowane przez geny onkosupresorowe odpowiada głównie za negatywną regulację podziału komórek, co pozwala na utrzymanie ich prawidłowego funkcjonowania. W procesie transformacji nowotworowej mutacja genomowa prowadzi do zwiększenia aktywności onkogenów i zmniejszenia lub utraty aktywności genów onkosupresorowych.
Mała zmienność i zmienność strukturalna. Są to dwa główne typy mutacji w genomie. Małe warianty zmieniają DNA poprzez zmianę, usunięcie lub dodanie niewielkiej liczby zasad, w tym insercję zasad, delecję, przesunięcie ramki odczytu, utratę kodonu start, utratę kodonu stop itp. Zmienność strukturalna to rozległa rearanżacja genomu, obejmująca segmenty genów o wielkości od kilku tysięcy zasad do większości chromosomu, w tym zmiany liczby kopii genów, delecję, duplikację, inwersję lub translokację chromosomów. Mutacje te mogą powodować zmniejszenie lub wzmocnienie funkcji białek. Oprócz zmian na poziomie pojedynczych genów, sygnatury genomowe są również częścią raportów z sekwencjonowania klinicznego. Sygnatury genomowe można postrzegać jako złożone wzorce małych i/lub strukturalnych zmienności, w tym obciążenia mutacjami nowotworowymi (TMB), niestabilności mikrosatelitarnej (MSI) i defektów rekombinacji homologicznej.

Mutacje klonalne i subklonalne. Mutacje klonalne występują we wszystkich komórkach nowotworowych, są obecne w momencie rozpoznania i pozostają obecne po zakończeniu leczenia. Dlatego mutacje klonalne mogą potencjalnie być wykorzystane jako cele terapeutyczne w leczeniu nowotworów. Mutacje subklonalne występują tylko w niewielkiej grupie komórek nowotworowych i mogą być wykryte na początku diagnozy, ale zanikają wraz z nawrotem choroby lub pojawiają się dopiero po leczeniu. Heterogeniczność nowotworów odnosi się do obecności wielu mutacji subklonalnych w jednym nowotworze. Co istotne, zdecydowana większość klinicznie istotnych mutacji napędowych we wszystkich powszechnych gatunkach nowotworów to mutacje klonalne, które pozostają stabilne w trakcie progresji nowotworu. Oporność, która często jest mediowana przez subklony, może nie zostać wykryta w momencie rozpoznania, ale pojawia się w momencie nawrotu po leczeniu.

Tradycyjna technika FISH, czyli kariotyp komórkowy, służy do wykrywania zmian na poziomie chromosomowym. FISH może być stosowana do wykrywania fuzji, delecji i amplifikacji genów i jest uważana za „złoty standard” w wykrywaniu takich wariantów, charakteryzując się wysoką dokładnością i czułością, ale ograniczoną przepustowością. W niektórych nowotworach hematologicznych, zwłaszcza w ostrej białaczce, kariotypowanie jest nadal stosowane do diagnostyki i prognozowania, ale technika ta jest stopniowo zastępowana przez ukierunkowane testy molekularne, takie jak FISH, WGS i NGS.
Zmiany w poszczególnych genach można wykryć za pomocą PCR, zarówno w czasie rzeczywistym, jak i metodą cyfrowej reakcji kroplowej (DPCR). Techniki te charakteryzują się wysoką czułością, są szczególnie odpowiednie do wykrywania i monitorowania małych zmian resztkowych oraz pozwalają uzyskać wyniki w stosunkowo krótkim czasie. Wadą jest ograniczony zakres detekcji (zwykle wykrywane są mutacje tylko w jednym lub kilku genach) oraz ograniczona możliwość przeprowadzenia wielu testów.
Immunohistochemia (IHC) to narzędzie do monitorowania oparte na białkach, powszechnie stosowane do wykrywania ekspresji biomarkerów, takich jak ERBB2 (HER2) i receptory estrogenowe. IHC może być również wykorzystywane do wykrywania specyficznych zmutowanych białek (takich jak BRAF V600E) i specyficznych fuzji genów (takich jak fuzje ALK). Zaletą IHC jest możliwość łatwej integracji z rutynowym procesem analizy tkanek, co pozwala na łączenie jej z innymi badaniami. Ponadto IHC może dostarczyć informacji o lokalizacji białek subkomórkowych. Wadami są ograniczona skalowalność i wysokie wymagania organizacyjne.
Sekwencjonowanie drugiej generacji (NGS) NGS wykorzystuje techniki sekwencjonowania równoległego o wysokiej przepustowości do wykrywania zmienności na poziomie DNA i/lub RNA. Technikę tę można wykorzystać do sekwencjonowania zarówno całego genomu (WGS), jak i interesujących regionów genów. Sekwencjonowanie WGS dostarcza najbardziej kompleksowych informacji o mutacjach genomowych, ale istnieje wiele przeszkód w jego zastosowaniu klinicznym, w tym konieczność użycia świeżych próbek tkanki nowotworowej (WGS nie nadaje się jeszcze do analizy próbek unieruchomionych w formalinie) oraz wysoki koszt.
Celowane sekwencjonowanie NGS obejmuje sekwencjonowanie całych eksonów i panel genów docelowych. Testy te wzbogacają interesujące regiony o sondy DNA lub amplifikację PCR, ograniczając tym samym zakres wymaganego sekwencjonowania (cały eksom stanowi 1 do 2 procent genomu, a nawet duże panele zawierające 500 genów stanowią zaledwie 0,1 procent genomu). Chociaż sekwencjonowanie całych eksonów dobrze sprawdza się w tkankach utrwalonych w formalinie, jego koszt pozostaje wysoki. Kombinacje genów docelowych są stosunkowo ekonomiczne i zapewniają elastyczność w wyborze genów do badania. Ponadto, krążące wolne DNA (cfDNA) wyłania się jako nowa opcja analizy genomicznej pacjentów onkologicznych, znana jako biopsja płynna. Zarówno komórki nowotworowe, jak i komórki prawidłowe mogą uwalniać DNA do krwiobiegu, a DNA uwalniane z komórek nowotworowych nazywane jest krążącym DNA nowotworowym (ctDNA), które można analizować w celu wykrycia potencjalnych mutacji w komórkach nowotworowych.
Wybór testu zależy od konkretnego problemu klinicznego, który ma zostać rozwiązany. Większość biomarkerów związanych z zatwierdzonymi terapiami można wykryć za pomocą technik FISH, IHC i PCR. Metody te są uzasadnione w przypadku wykrywania niewielkich ilości biomarkerów, ale nie poprawiają wydajności detekcji wraz ze wzrostem przepustowości, a jeśli wykrytych zostanie zbyt wiele biomarkerów, ilość tkanki może być niewystarczająca do ich wykrycia. W niektórych nowotworach, takich jak rak płuc, gdzie trudno jest uzyskać próbki tkanek i istnieje wiele biomarkerów do zbadania, lepszym wyborem jest zastosowanie NGS. Podsumowując, wybór testu zależy od liczby biomarkerów do zbadania u każdego pacjenta oraz liczby pacjentów, u których ma zostać wykonany test na obecność danego biomarkera. W niektórych przypadkach zastosowanie IHC/FISH jest wystarczające, zwłaszcza gdy zidentyfikowano cel, na przykład w przypadku wykrywania receptorów estrogenowych, receptorów progesteronowych i ERBB2 u pacjentów z rakiem piersi. Jeśli wymagana jest bardziej kompleksowa eksploracja mutacji genomowych i poszukiwanie potencjalnych celów terapeutycznych, NGS jest bardziej zorganizowana i opłacalna. Dodatkowo można rozważyć zastosowanie NGS w przypadkach, gdy wyniki IHC/FISH są niejednoznaczne lub niejednoznaczne.

Różne wytyczne wskazują, którzy pacjenci powinni kwalifikować się do badań genetycznych. W 2020 roku Grupa Robocza ds. Medycyny Precyzyjnej ESMO wydała pierwsze zalecenia dotyczące badań NGS dla pacjentów z zaawansowanym nowotworem, zalecając rutynowe badania NGS w przypadku zaawansowanego niepłaskonabłonkowego raka płuca, raka prostaty, raka jelita grubego, raka dróg żółciowych i próbek guzów raka jajnika. W 2024 roku ESMO zaktualizowało swoje wytyczne, zalecając włączenie raka piersi i rzadkich nowotworów, takich jak guzy podścieliska przewodu pokarmowego, mięsaki, rak tarczycy i nowotwory o nieznanym pochodzeniu.
W 2022 roku, w opinii klinicznej ASCO dotyczącej badań genomu somatycznego u pacjentów z rakiem przerzutowym lub zaawansowanym, stwierdzono, że jeśli terapia oparta na biomarkerach zostanie zatwierdzona u pacjentów z przerzutowymi lub zaawansowanymi guzami litymi, zaleca się wykonanie badań genetycznych u tych pacjentów. Na przykład, badania genomiczne powinny być wykonywane u pacjentów z przerzutowym czerniakiem w celu wykrycia mutacji BRAF V600E, ponieważ inhibitory RAF i MEK są zatwierdzone w tym wskazaniu. Ponadto, badania genetyczne powinny być również przeprowadzane, jeśli istnieje wyraźny marker oporności na lek, który ma być podany pacjentowi. Na przykład, egfrmab jest nieskuteczny w raku jelita grubego z mutacją KRAS. Rozważając kwalifikację pacjenta do sekwencjonowania genów, należy uwzględnić jego stan fizyczny, choroby współistniejące i stadium nowotworu, ponieważ szereg kroków wymaganych do sekwencjonowania genomu, w tym zgoda pacjenta, przetwarzanie laboratoryjne i analiza wyników sekwencjonowania, wymaga od pacjenta odpowiedniej sprawności fizycznej i oczekiwanej długości życia.
Oprócz mutacji somatycznych, niektóre nowotwory powinny być również badane pod kątem genów linii zarodkowej. Badanie w kierunku mutacji linii zarodkowej może wpływać na decyzje dotyczące leczenia nowotworów, takich jak mutacje BRCA1 i BRCA2 w raku piersi, jajnika, prostaty i trzustki. Mutacje linii zarodkowej mogą również mieć wpływ na przyszłe badania przesiewowe i profilaktykę nowotworów u pacjentów. Pacjenci potencjalnie kwalifikujący się do badania w kierunku mutacji linii zarodkowej muszą spełniać określone warunki, które obejmują takie czynniki, jak historia rodzinna raka, wiek w chwili rozpoznania i rodzaj nowotworu. Jednak wielu pacjentów (do 50%) będących nosicielami patogennych mutacji w linii zarodkowej nie spełnia tradycyjnych kryteriów badania w kierunku mutacji linii zarodkowej opartych na historii rodzinnej. Dlatego, aby zmaksymalizować identyfikację nosicieli mutacji, National Comprehensive Cancer Network (NCCN) zaleca, aby wszyscy lub większość pacjentów z rakiem piersi, jajnika, endometrium, trzustki, jelita grubego lub prostaty byli badani pod kątem mutacji linii zarodkowej.
Jeśli chodzi o czas wykonania badań genetycznych, ponieważ zdecydowana większość klinicznie istotnych mutacji determinujących rozwój nowotworu ma charakter klonalny i jest stosunkowo stabilna w trakcie progresji choroby, uzasadnione jest przeprowadzenie badań genetycznych u pacjentów w momencie rozpoznania zaawansowanego nowotworu. W przypadku późniejszych badań genetycznych, zwłaszcza po terapii ukierunkowanej molekularnie, badanie ctDNA jest korzystniejsze niż badanie DNA z tkanki guza, ponieważ DNA krwi może zawierać DNA ze wszystkich zmian guza, co sprzyja uzyskaniu informacji o heterogeniczności guza.
Analiza ctDNA po leczeniu może pozwolić na przewidzenie odpowiedzi guza na leczenie i wcześniejsze rozpoznanie progresji choroby niż standardowe metody obrazowania. Jednak protokoły wykorzystania tych danych do podejmowania decyzji terapeutycznych nie zostały ustalone, a analiza ctDNA nie jest zalecana, chyba że w ramach badań klinicznych. ctDNA może być również wykorzystywana do oceny małych zmian resztkowych po radykalnym usunięciu guza. Badanie ctDNA po zabiegu jest silnym czynnikiem prognostycznym późniejszej progresji choroby i może pomóc w określeniu, czy pacjent odniesie korzyści z chemioterapii adiuwantowej. Nadal jednak nie zaleca się wykorzystywania ctDNA poza badaniami klinicznymi do podejmowania decyzji o chemioterapii adiuwantowej.

Przetwarzanie danych. Pierwszym krokiem w sekwencjonowaniu genomu jest ekstrakcja DNA z próbek pacjentów, przygotowanie bibliotek i wygenerowanie surowych danych sekwencjonowania. Surowe dane wymagają dalszego przetwarzania, w tym filtrowania danych niskiej jakości, porównywania ich z genomem referencyjnym, identyfikacji różnych typów mutacji za pomocą różnych algorytmów analitycznych, określenia wpływu tych mutacji na translację białek oraz filtrowania mutacji linii zarodkowej.
Adnotacja genu sterującego ma na celu rozróżnienie mutacji sterujących i pasażerskich. Mutacje sterujące prowadzą do utraty lub wzmocnienia aktywności genu supresorowego nowotworu. Małe warianty prowadzące do inaktywacji genów supresorowych nowotworu obejmują mutacje nonsensowne, mutacje przesunięcia ramki odczytu i mutacje kluczowych miejsc splicingowych, a także rzadziej występujące delecje kodonu start, delecje kodonu stop oraz szeroki zakres mutacji insercji/delecji intronów. Ponadto mutacje typu missense i małe mutacje insercji/delecji intronów mogą również prowadzić do utraty aktywności genu supresorowego nowotworu, wpływając na ważne domeny funkcjonalne. Warianty strukturalne prowadzące do utraty aktywności genu supresorowego nowotworu obejmują częściową lub całkowitą delecję genu oraz inne warianty genomiczne, które prowadzą do zniszczenia ramki odczytu genu. Małe warianty prowadzące do wzmocnienia funkcji onkogenów obejmują mutacje typu missense i sporadyczne insercje/delecje intronów, które atakują ważne domeny funkcjonalne białek. W rzadkich przypadkach mutacje związane z skróceniem białka lub miejscami splicingu mogą prowadzić do aktywacji onkogenów. Zmiany strukturalne prowadzące do aktywacji onkogenów obejmują fuzję, delecję i duplikację genów.
Kliniczna interpretacja zmienności genomicznej ocenia kliniczne znaczenie zidentyfikowanych mutacji, tj. ich potencjalną wartość diagnostyczną, prognostyczną lub terapeutyczną. Istnieje kilka systemów klasyfikacji opartych na dowodach naukowych, które można wykorzystać do ukierunkowania klinicznej interpretacji zmienności genomicznej.
Baza Danych Onkologicznych Medycyny Precyzyjnej (OncoKB) Centrum Onkologicznego Memorial Sloan-Kettering klasyfikuje warianty genów na cztery poziomy w oparciu o ich wartość predykcyjną dla stosowania leków: Poziom 1/2 – zatwierdzone przez FDA lub klinicznie standardowe biomarkery, które przewidują odpowiedź na określony lek w określonym wskazaniu; Poziom 3 – zatwierdzone lub niezatwierdzone przez FDA biomarkery, które przewidują odpowiedź na nowe leki celowane, które wykazały obiecujące wyniki w badaniach klinicznych, oraz Poziom 4 – niezatwierdzone przez FDA biomarkery, które przewidują odpowiedź na nowe leki celowane, które wykazały przekonujące dowody biologiczne w badaniach klinicznych. Dodano piątą podgrupę związaną z opornością na leczenie.
Wytyczne Amerykańskiego Towarzystwa Patologii Molekularnej (AMP)/Amerykańskiego Towarzystwa Onkologii Klinicznej (ASCO)/College of American Pathologists (CAP) dotyczące interpretacji zmienności somatycznej dzielą zmienność somatyczną na cztery kategorie: stopień I – o silnym znaczeniu klinicznym; stopień II – o potencjalnym znaczeniu klinicznym; stopień III – o nieznanym znaczeniu klinicznym; stopień IV – o nieznanym znaczeniu klinicznym. Tylko warianty stopnia I i II mają znaczenie dla decyzji terapeutycznych.
Skala Molekularnej Operacyjności Klinicznej Celów Molekularnych (ESCAT) ESMO klasyfikuje warianty genów na sześć poziomów: Poziom I – cele odpowiednie do rutynowego stosowania; Faza II – cel, który jest wciąż badany i prawdopodobnie będzie wykorzystywany do przesiewowego badania populacji pacjentów, którzy mogliby odnieść korzyści z leku docelowego, ale potrzebne są dalsze dane, aby to potwierdzić. Stopień III – docelowe warianty genów, które wykazały korzyści kliniczne u innych gatunków nowotworów; Stopień IV – wyłącznie docelowe warianty genów poparte dowodami przedklinicznymi; Stopień V – istnieją dowody potwierdzające kliniczne znaczenie ukierunkowania na mutację, ale terapia pojedynczym lekiem przeciwko celowi nie wydłuża przeżycia lub można zastosować strategię leczenia skojarzonego; Stopień X – brak wartości klinicznej.